源起研究丨免疫诊断技术原理与应用（二）
在全球范围内，POCT、免疫诊断、生化诊断占据体外诊断市场的前三名，免疫诊断占比达24%。近年来我国免疫诊断产业发展迅速，随着技术的不断进步，免疫诊断取代POCT成为我国体外诊断市场规模最大的细分市场，占据31%的市场份额，免疫诊断在我国体外诊断行业中显得更受欢迎。众所周知，医疗行业具有较高的壁垒，因此，源起基金深度探究医疗领域，开展对免疫诊断行业研究。
免疫比浊
当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。
图 免疫比浊检测原理
特点：方便、稳定、快速（10min）；适用于常规的生化分析仪，仪器成本低；要求抗体的特异性和亲和力高，抗体用量较大，检测灵敏度偏低，抗干扰能力弱。
应用：已知一定浓度范围的抗原，如血浆蛋白：白蛋白（ALB）、转铁蛋白（TRF）、C-反应蛋白（CRP）、脂蛋白（a）、尿微量蛋白系列等；
发展：胶乳比浊：是将待测物质相对应的抗体包被在直径为15－60nm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的灵敏性。
2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）
图 不同标记技术的发展历史
将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行。将待检样本与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离未结合成分，加入酶标记的抗体（二抗），其与固相上的免疫复合物结合，经洗涤，加入酶反应底物和终止液，通过检测体系颜色的吸光度(A)值，进行定性或定量分析。
2.3.1间接法（检测抗体）与双抗夹心法（检测抗原）：
图 间接法与夹心法检测原理
2.3.2竞争法（检测抗原）：
图 竞争法检测原理
双抗夹心法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用，因此适用于分子量大的蛋白。而竞争法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此对小分子抗原如一些激素和药物等的测定常用此法。
特点：1）特异性高；2）由于使用酶标记抗原/抗体，它可以催化底物分子发生反应，产生信号放大作用，而使本法具有较高的灵敏度；3）可以进行绝对定量检测；4）检测步骤较多，耗时长，一般需要1-2h。
应用：目前主要用于传染病、寄生虫病及其他方面的定量与定性诊断。
发展：生物素/亲合素放大系统：
一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin），结合非常稳定，且亲合素和生物素都可与蛋白、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，亲合素又可以偶联多个酶标生物素，这种多级放大作用可以进一步提高检测体系的灵敏度。
图 生物素/亲合素放大系统
2.4 化学发光免疫分析
化学发光免疫分析技术包含免疫反应和化学发光两部分。首先将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，抗原或抗体与待检测物质特异性结合后，加入氧化剂或化学发光底物，经氧化或与底物产生反应后，化学发光物质会形成一个处于激发态的中间体，中间体回到基态会发射光子释放能量。由于化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，可以确定待测物含量。
图 化学发光原理与分类
表：不同化学发光方法比较
特点：发光强度在4-6个量级之间，与测定物质浓度间呈线性关系。这与酶联免疫分析的显色法测吸光度（OD 值）0.02-2.00的线性范围相比，优势明显。与荧光标记相比，不需要额外光源，仪器和试剂的成本降低。
应用：目前在大多数三级医院，化学发光已基本取代酶联免疫成为主流，检测范围涵盖肿瘤、传染病、甲功、激素、心标、优生优育等各个方向。
表 化学发光免疫诊断的主要检测项目
发展：纳米磁微粒化学发光（管式发光）
图 管式化学发光检测过程
该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性；新型纳米材料如纳米金、碳纳米管、碳纳米球、碳纳米纤维以及量子点等联用到CLIA中，大大提高了CLIA的信号强度和稳定性。
目前管式化学发光技术应用比较成熟，因首个样本出结果快，支持急诊插入样本，极大地满足了临床检测需求，已经在大部分定量检测项目上对放射免疫分析技术和酶联免疫分析技术形成替代，成为免疫诊断市场上的主流技术产品。
管式化学发光仪器与试剂需配套使用，形成封闭系统，为厂家提供了更宽的护城河。但不同厂家的检测结果往往不具有可比性，不管是国产与进口厂家之间、进口与进口厂家之间都是如此，原因是抗原表位、干扰物质、仪器构造、试剂性能等各不相同。
2.5 免疫层析
指将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合。若用胶体金标记抗体，抗原与抗体的结合会导致胶体金积聚，因为其本身为红色，使得该区域显示一定深度的颜色，通过眼睛观察就可以获得定性的结果。使用CCD相机对显色图片进行灰度量化分析，可以得到相对定量（半定量）结果。
图 免疫层析（胶体金法）原理
特点：操作简便、快速，不需特殊仪器与其他实验设备；
应用：早孕、心梗、传染病、药品、毒品等检测。主要用于即时检验与居家检验。
发展：时间分辨荧光免疫层析
当将含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的镧系元素离子螯合物荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线二抗结合。反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光（10-1000us），这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可对样品中待测物进行相对定量（半定量）检测。
图 时间分辨荧光免疫层析原理
图 时间分辨荧光检测原理
3.免疫诊断技术发展趋势
根据我国临床诊断市场两极化特点，我们认为免疫诊断技术有两个发展趋势值得重视。
3.1大医院检验科提效：高度自动化的多联检验技术
代表：流式荧光技术（液相芯片）
以荧光编码微球为核心（Luminex公司专利），集流式原理、荧光分析、高速数字信号处理等多种技术于一体，具有高通量、高灵敏度、重复性好等特点；可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等多领域的研究。
图 流式荧光技术原理
1）高通量：一次可同时检测2-500种生理病理指标，这与传统方法的逐个指标检测相比，是质的飞跃。
2）所需样本量少：仅需10μl,可做多个指标检测。
3）速度快：最快9600T/h，化学发光为600T/h。
4）重复性好：可以抽取其中的100颗微球读数，最终的数据取其均值或中位值，这样可将误差减到最小。
5）高敏感性和线性范围宽，与进口化学发光相当。
6）对仪器要求高，单个项目的试剂成本低。
应用：HLA配型、自身免疫病检测、过敏原检测、肿瘤标志物检测、基因突变检测、HPV分型等众多免疫、分子检测。
3.2 分级诊疗带来的多场景应用：小型智能化诊断技术
3.2.1 微流控芯片（固相芯片）
微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统，将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上，加载生物样品和反应液后，采用微机械泵。电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动，形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应。
图 微流控芯片原理
特点：高通量、所需样本少；操作简便、不需额外耗材、对仪器要求低；封闭式设计可防止对环境的污染。但其对复杂样本分析较为困难；由于空间小，液流量小，因此检测灵敏度和精密度相对较差。
应用：适合高浓度的多指标快速检测，及避免污染的分子检测领域。
3.2.2 POCT
即时检验（point-of-care testing），指在病人旁边进行的临床检测及床边检测，通常不一定是临床检验师来进行。根据中国医学装备协会POCT 装备技术专业委员会的定义，是指采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。
POCT主要应用的技术包括干化学技术、免疫层析技术、免疫荧光技术、免疫比浊技术、微流控技术、生物传感器技术，测试对象也由生化指标、免疫指标逐步外延到核酸指标。
生物传感器：偶联一个特定的生物检测器（如酶、抗体或核酸探针）到一个换能器用于靶分析物的直接测定而无需从基质中分离它。商业的POCT仪器用电化学技术（如微型离子选择电极）和光学生物传感器去测定葡萄糖，电解质（K+、Na+、Cl-等）和血气（PH、PCO2、PO2等）。随着抗体固定技术和特异DNA序列的应用，生物传感器探针将很快用于检测激素、药物、难于培养的细菌、病毒等。
特点：
1）仪器小型化、一体化；不需额人工处理；
2）检测快速：30min内；
3）能够节约综合成本（场地、人力等）；
4）对试剂稳定性要求高、对精密度要求相对较低
5）定性与半定量检测为主。
应用：海关、学校、战争、重大自然灾害、重大疫情等现场应用场景；在心脏标志物、凝血、血气、传染病、毒品、血糖等检测领域具有应用优势。
4.总结
本报告主要介绍了以下免疫诊断技术的原理与应用：
1）免疫学诊断的基本概念与物质基础：抗原、抗原决定簇、抗体、制备；抗原与抗体结合特点（特异性、可逆性、比例性）；体外诊断试剂评估指标（检测限、检测灵敏度、特异性）；
2）免疫诊断技术原理与应用：免疫组化（免疫荧光）、免疫比浊（胶乳比浊）、免疫层析（时间分辨荧光免疫层析）、 酶联免疫吸附（间接法、双抗夹心法、竞争法、生物素/亲和素放大系统）、化学发光（管式发光）。
3）免疫诊断技术发展趋势：流式荧光技术、微流控芯片技术、POCT。
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