五、CAR-T疗法

 

（一）主要适应症和常见血液瘤流行病学

淋巴瘤、白血病及多发性骨髓瘤等血液疾病是中国常见的恶性肿瘤，血液瘤诊断通常是骨髓检查和影像检查。大部分患者会选择化疗、靶向药、免疫药物治疗，条件合适的患者会选择骨髓移植。当前疗法的主要缺陷体现在总反应率低、复发率高、副作用大、治疗周期长、价格昂贵。由于关键药物的缺失、辅助疗法的不足、早期诊断率的低下，我国血液瘤5年存活率较低，非霍奇金氏淋巴癌和多发性骨髓瘤的5年存活率分别约为37%和25%，远低于美国同期适应症存活率。复杂性及复发性的恶性血液病缺少有效治疗手段，CAR-T疗法获批产品多用于四线、三线治疗，用于二线、一线适应症的临床试验正在进行中。

图｜血液肿瘤CAR-T商业化产品

淋巴瘤是淋巴细胞(B细胞、T细胞)等在淋巴结中癌变导致的一种恶性肿瘤，常见的发病区包括脖颈、腋下、腹部、骨盆等。根据发病时细胞形态的不同，淋巴瘤分为两类，霍奇金淋巴瘤(HL)约占10%，非霍奇金淋巴瘤(NHL)约占90%白血病根据发病细胞的不同，可以分为淋巴细胞白血病(LL)和髓细胞白血病(ML)，根据发病急缓又可以进一步分为急性和慢性，淋巴性白血病ALL和CLL，髓细胞白血病AML和CML。

图｜CAR-T疗法主要适应症

血液瘤主要包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)，2020年全球分别新增约54万和18万患者，死亡人数分别为26万和12万。非霍奇金氏淋巴瘤包括多种淋巴瘤，其中最为普遍的是弥漫大B细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤。我国非霍奇金氏淋巴癌和多发性骨髓瘤2020年新增患者分别约9万和2万，且呈快速增长趋势。

CD19是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原，是B细胞淋巴瘤的最好标记；BCMA在浆细胞中高水平选择性表达，是理想的多发性骨髓瘤治疗靶点。

图｜常见血液瘤流行病学

（二）CAR-T疗法面对的挑战和解决策略

 

CAR-T疗法取得了巨大成功，但在有效性、安全性和可获得性方面仍存在诸多挑战。

图｜CAR-T疗法挑战和策略

1.持久性不足，高复发

CAR-T治疗疾病的复发，主要由于CAR-T持久性和增殖能力不足导致CAR-T细胞耗竭，无法继续提供肿瘤杀伤作用，增强型CAR-T是T细胞耗竭破局关键点，双/多靶点CAR-T可提高抗原覆盖率。

基于细胞因子相关通路的增强型CAR-T可改善细胞扩增能力和持久性。通过工程改造以表达细胞因子及其受体，细胞因子可以自分泌方式增加T细胞的存活和扩增，以旁分泌方式发挥作用，调节周围环境，干扰TME中存在的免疫抑制细胞因子。阻断免疫检查点，不能逆转耗竭，但可加强持久性。通过基因编辑敲除免疫检查共抑制分子PD-1、CTLA-4、TIM3和TIGIT，表达分泌免疫检查点抗体，或与免疫检查点抑制剂联合使用。

双/多靶点CAR-T提升有效率，降低复发率。通过提高抗原覆盖率，克服抗原逃逸与抗原异质性，临床证实能够提升CAR-T有效率并降低复发率，长期缓解待更长时间验证。进入临床阶段的双/多靶点项目90个左右，靶点组合主要集中在常见成熟靶点，如CD19、CD20、CD22、BCMA，CD19占据半数以上。

图｜常见双靶CAR模式

2.实体瘤靶点缺乏，肿瘤微环境抑制免疫

实体瘤由于特异性靶点缺乏，以及肿瘤微环境的复杂性等原因，对细胞治疗反应不佳。寻找差异化靶点，创新策略设计CAR-T，采用替代疗法TIL、TCR-T和CAR-M，可助力CAR-T攻克实体瘤。

CAR-T治疗实体瘤有主要三个障碍。首先，肿瘤内部细胞抗原复杂，靶抗原选择和CAR-T抗原结合域组合设计是难题，治疗后容易导致靶抗原下调或者丢失。其次，CAR-T细胞运输到肿瘤并保证活性和穿透性是决定疗效的重要因素。最后，实体瘤的肿瘤微环境(TME)与血液瘤不同，还包括浸润性和驻留免疫细胞、基质细胞以及许多促炎和抗炎介质，相互作用复杂，多数情况下会抑制CAR-T细胞引起的抗肿瘤和免疫反应。

针对这三个障碍采取相应策略来提高CAR-T细胞功能。

从肿瘤抗原着手增强特异性，新一代基因组和蛋白组学研究着重于发现新的肿瘤特异性抗原，现在临床应用多是针对肿瘤相关抗原的改进，例如调节scFv或VHH的亲和力，或设计可以靶向多个肿瘤抗原/肿瘤干细胞的CAR，CAR的设计是实体瘤中应用的主要壁垒。

增强到达肿瘤部位的T细胞活性和浸润冷肿瘤能力。让CAR-T细胞到达肿瘤部位再被激活，如将CAR改造成多西环素调控表达，或利用TME缺氧、synNotch受体调控表达，或表达一个靶向正常组织抗原的抑制CAR(CD19/PSMA)。工程菌提供Target，精准定位肿瘤，工程菌选择性地在肿瘤中生长，内含同步裂解电路，在肿瘤中裂解释放出 ProCAR-Target，招募CAR-T至肿瘤细胞。增强T细胞活性，例如增加CAR共刺激或激活区域，表达激活免疫系统的细胞因子、细胞因子受体、转录因子或肿瘤分泌的趋化因子，如IL7xCCL19 CAR-T。

实体瘤中混杂了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，髓系来源抑制细胞，调节性T细胞和肿瘤相关成纤维细胞等，这些细胞会激活肿瘤生长转移，抑制免疫系统。成纤维细胞激活蛋白FAP-CAR-T能有效地克服物理屏障和TME渗透进肿瘤巢，与TAA靶向的Meso-CAR-T顺序给药，可增强肿瘤浸润和杀伤性。靶向TAM的CD123或FRβ-CAR-T均在临床前展现了优秀的抗肿瘤反应。另外TME中细胞表达多种免疫检查点蛋白，阻断 PD-1/PD-L1可直接对抗免疫抑制反应，或表达显性失活/细胞因子开关受体来把抑制信号转换成生长激活信号，其中IL-4/IL-2 细胞因子开关正在早期临床验证中。

图｜已进入临床试验的CAR-T实体瘤靶点

替代疗法TIL和TCR-T、CAR-M。TIL细胞疗法制备难度大、操作流程复杂、商业化具备风险，制备工艺优化缩短制备时间和使用基因修饰方案打造基因编辑型TIL提高靶向性/疗效成为主要发展趋势。TCR-T未来趋势可重点关注靶点选择和突破HLA限制性，安全有效的靶点选择是TCR-T细胞疗法成功关键，优化的TCR可以高亲和力结合肿瘤细胞内/外抗原，降低HLA限制性，提高肿瘤杀伤效力，目前通用型TCR-T研究处于探索阶段。CAR-M是解决实体瘤TME痛点的新探索，处于早期研发阶段，目前仅有1个项目进入临床阶段。巨噬细胞容易浸润肿瘤环境，特异性CARs修饰巨噬细胞，渗入TME并发挥靶向效应子功能，吞噬肿瘤细胞，抗原呈递来激活T细胞。

图｜CAR-M吞噬肿瘤细胞及抗原呈递机制图

图｜CAR-M制备技术路线与主要细胞来源途径

3.细胞因子风暴和非靶向肿瘤毒性

设计可调节开关CAR-T和逻辑门控CAR-T精准靶向，减少脱靶毒性。安全开关和逻辑门控精准调控CAR-T杀伤活性，开关可调节(on/off switchable)CAR-T通过多种开关设计策略，使CAR-T在开关之间灵活切换，逻辑门控通过对正常细胞和肿瘤细胞抗原的区分，控制CAR-T仅杀伤肿瘤细胞而不伤害正常细胞，精准杀瘤，限制脱靶毒性。

图｜常见CAR-T开关设计

图｜逻辑门控CAR-T

4.制备流程复杂，价格昂贵

自体CAR-T生产复杂耗时，需要提取患者自身的T细胞进行基因工程改造、扩增并回输。由于T细胞具备免疫原性，需要每个患者一批次，导致生产检测成本高达10-20万美金/人份，从而影响药物的商业化放量。在经历多线治疗后并非所有患者自身T 细胞都足够健康可以进行改造，约 5%的患者自体T细胞无法改造生产 CAR-T。制备时间需要2-3周，患者等待时间较长，获批的末线血液瘤恶化迅速，少数患者会在等待制备的时间中病情恶化死亡。

快速CAR-T疗法，异体CAR-T,In Vivo CAR-T和替代疗法CAR-NK可改进制备流程，降低成本。

图｜CAR-T疗法制备流程

快速CAR-T疗法改进了传统自体疗法的制备时间和T细胞干性，早期临床展现出与传统方法相当的安全性和有效性。诺华和亘喜生物的快速CAR-T技术平台，可以把行业标准的制备时间缩短到2天内，CAR-T细胞转染和激活同步进行，同时省去1-5周的体外扩增环节。这使T细胞受损程度和耗竭相应减少，强化T细胞的适应性，更为患者提供了及时治疗，显著降低生产的人工和耗材成本。

快速CAR-T技术平台临床进展(截至2022年1月)

异体CAR-T的制备从健康T细胞供体开始，使用病毒载体侵染敲除T细胞受体(TCR)的αβ亚基和CD52，再进行激活和扩增，剩余的有αβ亚基TCR的T细胞则使用抗αβ亚基TCR抗体磁珠去除，最后冻存备用。异体CAR-T具备批量生产、现货取用、可多次给药、价格适中的优势，同时存在两个待解决问题，基因编辑风险、GvHD、攻击宿主细胞、淋巴耗竭风险，以及体内存活时间短，仅几周到几个月。多个异体CAR-T项目进入临床阶段，免疫排斥为重点关注问题，现今临床效果难以超越自体CAR-T。基本采取TRAC敲除方式，也有通过多基因敲除解决T细胞存活时间的尝试，或尝试同时敲除PD-1，防止出现T细胞被免疫抑制的问题。

图｜自体异体CAR-T比较

图｜异体CAR-T临床阶段项目

解决异体CAR-T免疫排斥常用方法是敲除异体CAR-T细胞上的MHC I(B2M)，但HLA I完全缺失的细胞容易被NK细胞识别并杀死(基于missing self recognition)，解决方案之一是加入HLA-E或HLA-G。也可选用不同T细胞亚型，多种T细胞亚型无MHC限制性，进行工程化CAR改造，已显示出临床治疗潜力，而且具有降低GvHD潜在优势。异体γδ-T细胞不依赖MHC结合的靶细胞抗原识别特性，可防止引起GvHD，更方便应用于异体通用式疗法，适应症以实体瘤为主，最快进行至临床Ⅰ期。

图｜不同T细胞亚型

In Vivo CAR-T省去复杂的体外制造过程，简化生产治疗流程，缩短了时间，使治疗更及时，还可以规避GvHD，降低治疗风险，减少不良事件的发生。目前In Vivo CAR-T处于早期探索阶段，多家国外企业布局，国内企业鲜有布局，泰远生物和臻愈生物进军这一领域。靶向基因递送的准确性对In Vivo CAR-T细胞生成至关重要，临床前结果初步验证成效。

图｜In Vivo CAR-T体内递送策略关键特点

现货型CAR-NK疗法有望解决可及性。与CAR-T相比，CAR-NK具有天然的抗肿瘤毒性和更好的通用型产品潜力，NK细胞来源多样，同种异体的安全性也更好，不会引起GVHD和明显毒性。NK细胞制备途径广泛、成本低，可以从外周血(PB)、脐带血(UCB)、诱导多能干细胞(iPSC)及NK-92细胞系等多渠道获取。NK细胞在体内的持续时间较短，CAR-NK安全性更高，可降低移植物抗宿主病(GvHD)，细胞因子释放综合征(CRS)风险。CAR-NK更有利于成为“现货型”免疫细胞疗法产品，实现大规模产业化应用，兼具治疗费用低的优点。

CAR-NK目前早期临床治疗血液瘤和实体瘤的有效性和持久性远逊于CAR-T疗法，且需要抗体药物联用，多次进行清除淋巴细胞和输注疗程，但因安全性优秀，更多研发投入在改进其疗效上。多重基因修饰提高有效性，克服NK细胞功能衰竭、自相绞杀、细胞毒性低、肿瘤免疫环境抑制等不足。异位表达趋化因子受体增强NK细胞的运输和浸润肿瘤的能力，敲除NK免疫功能负调节因子基因/干预代谢途径克服功能衰竭，敲除表面和细胞内分子防止自相残杀或免疫抑制来调节NK细胞进行联合治疗，抑制性受体的靶向基因消融保护CAR-NK细胞对抗免疫抑制性肿瘤微环境。