四、类器官的培养

除了成体干细胞，多能干细胞也可以利用其自我更新及分化能力来制备类器官。由于从多能干细胞中提取的类器官是通过同质群体定向分化而形成的，因此必须在一个唤醒胚胎发生的动态过程中重新创造组织特异性细胞类型及其微环境。

因此，多能干细胞类器官培养必须在分化过程中提供合适的生态位信号。由于这一过程较复杂，多能干细胞类器官往往含有不同于模型器官的细胞类型，使靶组织的信号环境和自组织复杂化。

（一）培养流程和条件

类器官的培养从获取组织样本开始，经历冷链运输至实验室、自动化仪器解离细胞、类器官培养、类器官鉴定等环节，得到高质量类器官。类器官的形成和成熟是在单细胞或小细胞簇扩展和重组之前进行的。

类器官培养首先要分离出胚胎或多能干细胞，然后将其培养在一个支持介质上，进行三维生长。介导类器官形成的信号通路与体内器官发育与稳态维持的信号通路相同，在培养过程中需要添加各种细胞因子，以激活或抑制参与类器官形成的信号通路。制备不同类器官需要使用不同细胞因子组合。已经开发了各种工作流程来生成类器官，特殊类器官需要独特培养方法，并不是所有通用工作流程都适用。

培养流程的关键环节是样本制备和细胞培养条件控制及生长因子的选择。类器官建立基本流程如下：首先获得组织，组织类型主要包括正常组织、肿瘤组织和活检组织。

针对手术切除的组织在消化解离前需要先剔除没用的部分，也就是脂肪和肌肉组织。剔除之后进一步进行消化解离，取一部分保存进行分子生物学实验，剩余部分包裹在基质胶中，然后滴注到培养板上形成PDO，生长到一定程度之后进行传代和药敏实验。

 

图|从原生组织培养口腔黏膜类器官的过程

类器官培养试剂主要包括消化液、基质胶(Matrigel等)、维持类器官生态所需因子和分化所需因子这几个主要元素。基质胶中含有胶原、巢蛋白和纤连蛋白等等，为类器官形成三维空间结构提供基质。维持类器官生态因子主要目的为促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡等。

这些试剂在不同实验室、公司以及培养不同种类的类器官之间差异性较大。类器官作为新型药筛模型，成本虽然较PDX更低，但还是远高于细胞系，成本占比较高的包括基质胶和细胞因子。

1.样本来源

类器官建立成功与否很大程度上取决于取到的组织标本，新鲜组织还有丰富上皮组织的样本更容易培养出PDO，所以要把前期工作做好，样本保持在4℃ DMEM/F12基础培养基中，并添加10μM的Y-27632能够更好地保持细胞活性。

2.培养基

类器官的构建依赖于3D培养环境，其中悬浮的培养基品质是关键，一类是基础培养基，一类是另外添加的各种因子。最常用的培养基是基底膜提取物/基质胶(BME)，BME包含多种组分如胶原蛋白IV、层粘连蛋白等，对于维持干细胞或前体细胞未分化状态有重要作用，并不是单纯提供一种固态支持的作用。在某些情况下，类器官可以在没有细胞外基质的情况下成功培养，例如乳腺肿瘤生长和分化的乳腺细胞系。

3.生长因子

生长因子是类器官培养基的重要组成部分，因为它们通过一系列信号通路组合的操作来指导干细胞的分化，这些信号通路可以生成和维持特定的类器官类型。

基础培养基之外的生长因子会随着肿瘤类型的不同而发生变化，但基本上都会包含着四类因子：Wnt信号通路激活剂；酪氨酸受体激酶的配体，刺激上皮细胞增殖；TGF-β信号通路抑制剂，抑制上皮细胞分化；ROCK抑制剂，保持干细胞多能性。

 

图|类器官生产中的生长因子和小分子抑制剂及其作用

4.基质胶

基质膜是特定细胞外基质，在内皮细胞、上皮细胞、肌肉或神经细胞间形成界面，不仅可以支持细胞层，还在组织形成中影响细胞粘附、迁移、增殖和分化。

全球领先的基质胶/基底膜提取物，提取于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤，在37℃重新形成基底膜，其主要成分是胶原蛋白IV、层粘连蛋白等，还包含生长因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF等，主要用于支持细胞生长和分化，也用于细胞粘附、血管新生、提取外细胞迁移/侵袭和体内成瘤实验等。对于维持干细胞或前体细胞未分化状态有重要作用，并不是单纯提供一种固态支持的作用。

（二）人源肿瘤类器官PDO的培养方法

PDO的样本来源通常为肿瘤组织或者胸腹水等恶性积液，主流培养方法包括较为常用的正置胶滴法、适用于肿瘤和睾丸类器官培养的倒置胶滴法、适用于有气体接触的黏膜类器官(肠、呼吸道)培养的气液界面法以及需要较大扩增(脑类器官)的生物反应器法等。

首先将患者来源的肿瘤样本组织通过机械剪切得到肿瘤细胞团，再将细胞团酶消化成单细胞。分离消化后，将细胞嵌入到基质胶中并在96/384孔板上进行胶滴的种接，再覆盖以培养基和细胞因子培养。类器官培养至直径几百微米的细胞小球即可用于药筛。

正置胶滴法是较为常用的类器官培养方法，倒置胶滴法又叫悬滴法，是近年来细胞三维培养的一种，操作简便，可以在悬浮状态下自发成球。

悬滴细胞培养方法是通过将单细胞悬液形成一个个独立悬滴，细胞在悬滴内聚集成细胞球。气液界面培养被认为是呼吸系统生理学高度相关的培养体系，能够克服2D培养的许多挑战。

生物反应器法是以生物反应器为核心，通过悬浮或者支架贴壁的方式在生物反应器内构建3D培养环境，采用工程技术手段对生物反应器内的环境参数如温度、pH值及溶解氧浓度等实时在线测控，并辅以循环灌注的手段，加强营养传输和物质交换，从而构建适合细胞生长增殖的培养条件。动物细胞体外培养时，生物反应器是整个培养过程的关键设备，为细胞提供了一个适宜的生长环境，使之快速增殖并形成所需的生物组织制品。

（三）科学研究中的类器官培养

1.上皮类器官研究上皮细胞-免疫细胞相互作用

上皮细胞出现在机体所有和外界接触的边界，比如皮肤，呼吸道，肺，消化道，是机体对抗病原体侵染的第一层屏障，也是第一个对病原性感染作出反应的细胞。为了维持体内平衡，并提供对感染的快速反应，上皮细胞与免疫细胞密切配合。

所以，在上皮区域，也是全身免疫细胞浓度最高的区域。建立上皮细胞和免疫细胞相互作用的模型，是研究抗感染免疫和损伤后免疫的重要手段。上皮细胞类器官的建立，可以非常精准的模拟机体上皮环境，也被发展起来研究上皮和免疫细胞相互作用。有三种共培养模式：

①用存在于细胞外基质中的重组细胞因子处理类器官，评价免疫细胞衍生细胞因子对于上皮细胞的影响。如IL-4和IL-13促进丛生细胞分化，而IL-22支持干细胞增殖和存活。

②将器官消化到单个细胞，然后在免疫细胞存在的情况下，再生长。用于评估免疫细胞和免疫细胞衍生的细胞因子(可溶性或膜结合)对器官生长和分化的影响，以及上皮细胞对免疫细胞表型的影响。

③在ECM或生长培养基(悬浮培养)中，向完整类器官中添加(活化的)免疫细胞，如T细胞或固有淋巴样细胞(ILCs)，以评估免疫细胞与上皮细胞之间的相互作用。这些检测的读数通常包含消化形成的器官和随后的转录。单细胞RNA测序或定量PCR，成像和/或流式细胞术评估上皮细胞和/或免疫细胞表型。在这些共培养中使用的免疫细胞或者直接从小鼠组织中分类，或者直接从人外周血中提取，或者先在体外分化。

 

图|上皮类器官三种共培养模式

2.胸腺类器官研究T细胞发育

胸腺是T细胞成熟和从祖细胞向成熟的幼稚淋巴细胞分化的中心部位。来源于骨髓的T细胞祖细胞在胸腺皮质进行阳性选择，随后在胸腺髓质中进行阴性选择。胸腺的这些区域由两种不同的上皮细胞组成，皮质胸腺上皮细胞(CTECs)和髓质胸腺上皮细胞(MTECs)。

3D重建胸腺被证明是模拟其功能的关键，几种胸腺类器官的产生方法：器官培养通常是从人类身上建立起来的或胎鼠或新生儿胸腺组织，但也有报道称TEC样细胞与人胚胎干细胞的体外分化，这些培养都产生胸腺样结构。

在体外产生活的T细胞，并在移植到裸鼠上时发挥作用。虽然长时间的类似胸腺的培养是可能的(离体培养长达56天)，但细胞在连续传代时失去了集落形成能力。

重要的是，虽然在成年小鼠中已经发现了一种双能的TEC前体，但含cTECs和mTECs的胸腺器官尚未从单个干细胞中生成。此外，考虑到小鼠体内某些双能TEC前体的生长因子已被发现(例如BMP 4和IL-22)，可以尝试这些因子是否可用于维持TEC的祖细胞来源的类器官。

（四）肿瘤微环境

两种主要的方式被使用。以非小细胞肺癌为例，在整体方法中，肿瘤活检组织是在气液界面间环境培养，所有肿瘤细胞类型的细胞悬液，包括内源性免疫细胞和其他非上皮细胞类型，促进肿瘤特异性T细胞的生长。

在还原模拟方法中，上皮类器官是从肿瘤活检组织中生长出来的，然后与来自同一患者外周血的自体免疫细胞共培养，以促进肿瘤反应细胞的连续扩张。虽然整体方法允许包括整个肿瘤微环境的肿瘤材料的培养，因此与体内情况非常相似，但不易长时间维持，而还原模拟方法允许肿瘤上皮的长期培养和扩展，这使得更广泛，更长期的研究成为可能。

（五）药物筛选

1.促进心肌纤维细胞生长化合物筛选

由于许多功能和生物学特性的物种差异很大，动物模型对人类心脏疾病和药物安全性的推断很差。人类多能干细胞(hPSC)可以为生物医学和药物研究提供无限的人类心肌细胞来源，有可能弥合这一鸿沟。然而传统2D培养中的hPSC源性心肌细胞缺乏功能成熟，这在某些情况下阻碍了它们准确预测人类生物学和病理生理学的能力。

多细胞3D人体类器官提供了更精确的模型，是解决这一问题的潜在方法。澳大利亚昆士兰大学生物医学系的科学家基于96孔板培养心脏心肌类器官，进而进行化合物筛选，从5000种化合物中筛选出不同功能化合物。

2.特定神经类器官培养及药物筛选等应用

神经球在不同分化培养基种培养(具体诱导因子及生长因子见下图)，产生大脑，中脑，海马，前脑等不同脑部类器官。

 

图|神经球在不同分化培养基种培养产生不同脑部类器官

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