​合成生物学是指对生物体进行有目标的设计、改造、重新合成，甚至创建并赋予其非自然功能的“人造生命”。无细胞合成生物学正在发展成为其中一种强大有效的手段，其目的是在不使用整个活细胞的情况下，理解、利用和扩展自然生物系统的功能。

无细胞蛋白质合成亦被称为体外蛋白质，是一种用于补充基于细胞的蛋白质表达的技术，其合成系统无需完整的活细胞就可以在体外受控环境中模拟整个细胞的转录和翻译过程，并允许对单个成分和反应网络进行详细深入的研究。

因此，无细胞蛋白质合成作为一种平台技术，有望克服当前胞内生产系统中因为细胞膜约束带来的表达局限性，在基础科学研究和应用科学研究中具有广阔的前景。

无细胞蛋白质合成系统概述

无细胞蛋白质合成（cell-free protein synthesis，CFPS）是无细胞合成生物学的技术核心，也被称为体外蛋白质转录翻译技术，该技术作为基础和应用生物学的研究工具已经使用了近70年。

CFPS通过提取核糖体、氨酰-tRNA合成酶、翻译起始和延伸因子、核糖体释放因子等转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的元素，并向其中添加DNA模板、能量和各种辅因子，模仿胞内环境以合成目标蛋白质。

CFPS系统最初是由Nirenberg和Matthaei在20世纪60年代开发的，在发现遗传密码方面发挥了重要作用。在过去的20年里，CFPS系统经历了飞速的发展，以满足对廉价和快速重组蛋白表达技术的日益增长的需求，这导致了众多高活性CFPS平台的发展。通过PubMed搜索关键词“cell-free protein synthesis”分析1953—2020年公开论文发表数量，可以看到CFPS技术一直受到广泛的使用和关注。

 

图 | 每年CFPS论文发表数量（来源：CSCD）

CFPS之所以能够飞速发展，主要是其具有快速表达具生物活性重组蛋白的潜力。具有这种潜力的主要原因是其相较于细胞体系的特有优势。

首先，CFPS系统使用细胞提取物来模拟细胞内的环境，无需完整的活细胞且没有细胞膜的限制，是一个开放的合成系统。

其次，系统中的所有物质与能量都可以用于生产感兴趣的蛋白质，大大提高了蛋白质的表达效率。这些优势克服了传统的基于细胞的蛋白质合成系统的很多局限性。

此外，CFPS可以使用线性DNA作为表达模板，避免了基于质粒方法克隆步骤的耗时问题，使CFPS系统成为有潜力的高通量筛选工具。

 

图 | 体内细胞和体外无细胞蛋白质合成比较（来源：CSCD）

随着CFPS的快速发展，CFPS系统类型已经多种多样。一类是提取物系统，根据细胞的提取物类型可分为高使用率模式细胞类型和低使用率非模式细胞类型。高使用率模式细胞类型主要包括大肠杆菌、酵母、小麦胚芽、昆虫、中国仓鼠卵巢和兔网织红细胞等。

无细胞人工“生命体系”构建中的应用和研究进展

为合成具有新的特性、结构和功能的蛋白质，应在CFPS体系中加入编码该蛋白的DNA或mRNA模板，以及氨基酸和核苷酸等来启动转录和翻译过程。CFPS系统利用微生物、植物或动物细胞的粗提物产生核糖体、氨酰-tRNA合成酶、翻译起始和延伸因子、核糖体释放因子等转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的元素。

传统的无细胞反应模式包括两类：批式反应和连续交换反应系统。批式反应装置简单，较易实现，所有的无细胞反应组分添加到一个试管中，可以快速合成目标蛋白质。然而，这种反应模式存在局限性，能量和氨基酸的消耗以及副产物的积累，特别是副产物对体外转录/翻译有抑制作用，使得产率低下。为克服该缺点，科学家设计了连续交换无细胞反应系统。

 

图 | 无细胞蛋白合成过程（来源：CSCD）

CFPS技术已实现了廉价且快速的重组蛋白质表达，其灵活性、可控性以及操作便捷等优势迅速扩大其用途并逐步商业化。目前，各种原核和真核生物的无细胞平台已经投入使用。

以人工生命体系的构建为例，主要有分两步，一是噬菌体的合成；二是人工细胞的构筑。

噬菌体的合成：由于噬菌体对宿主的极端特异性，以及显示出作为抗菌剂和细菌诊断的巨大医学潜力，噬菌体目前已经广泛应用于抗菌剂的研发、细菌诊断、疫苗研发、噬菌体聚合酶的合成以及用作遗传可编程生物材料的支架等多个方面，并且在定向进化研究中发挥重要作用。然而，大多数噬菌体的基因组太大（>20 kb），很难在体外进行操作，而且对细菌宿主是致命的；体外转录翻译无细胞表达系统，为噬菌体的合成和改造提供了更精确控制的可能性。

人工细胞的构筑：构建具有生命基本特征的人工细胞是合成生物学领域的一大挑战，至今对其仍然没有一个明确的定义。尽管生命系统具有高度的内在复杂性，但一般认为具备5个共同特征：区室化、生长分裂、信息处理、能量转导和适应性。利用分子生物学工具和方法，自下而上将功能分子组装成人工细胞，虽可实现基本的生命特征，但在实现自组装、自我繁殖等方面面临重大挑战。目前大量利用无细胞转录翻译系统模拟细胞结构和特征的工作已经开展，如分子拥挤、区室化、基因噪声、网络、动态行为和细胞通讯，致力于构建更“完美”的人工细胞。

 

图 | 人工细胞的构建（来源：CSCD）

脂质体因其良好的生物相容性、生物可降解性、易制备和高包封性等特点［148］，最常用来构筑人工细胞。

在区室化构筑的研究中，研究最多的是基于囊泡和人工制备脂质体的人工细胞，脂质囊泡可以高效地包裹无细胞系统实现蛋白质的表达，从而形成高效可控的人工细胞系统。此外，微流控技术可以通过调整流速和通道尺寸精确控制液滴大小和形状，在人工细胞构筑方面受到越来越多的关注。

细胞通讯或信息传递作为生命体系的重要特征，亦是人工细胞构建的主要目标之一，通常通过物理或化学信号递送来实现。

随着基于无细胞转录翻译系统的人工细胞的发展，从进化生物学基础研究到生物医疗应用研究都得到广泛拓展。该团队通过使用基于磷脂的囊泡展示了原始细胞的生长-分裂机制；人工细胞的发展还推动了无细胞生物传感的研究；在医学领域，可将人工细胞构筑用于药物筛选。

然而，要真正实现“完美”人工细胞的构建，还需要实现自我复制、新陈代谢和信息处理等复杂功能，这仍然需要未来在相关领域的进一步拓展。

无细胞蛋白质合成系统机遇和挑战

综上所述，无细胞蛋白质合成系统作为一种强大的合成生物学技术平台，因其开放性、可控性、高效性、灵活性等诸多优点，在过去5～10年时间里得到了多样化的大力发展，其应用跨越了生物制造、生物催化、生物医药、生物传感、人工细胞等重要基础和应用研究领域。各种不同的CFPS技术平台进一步使具有不同复杂性和物种来源的蛋白质的体外生产成为可能。

然而，无细胞蛋白质合成系统的发展中，仍然面临诸多挑战。

规模化和成本是工业制造中的两大关注点。该系统的进一步发展需要无细胞蛋白质生产系统规模的扩大。一些难合成蛋白质的生产离不开动物和昆虫细胞提取物，而这些提取物的制备较为繁琐，有些耗时较长，是扩大工业化生产有待解决的一大问题。

与此同时，一些应用的发展常常受到试剂费用的限制。例如，在大肠杆菌CFPS系统中，如果以质粒为表达模板，以葡萄糖为供能系统，合成非天然绿色荧光蛋白每100 μg的总成本为0.658美元。为进一步提高产量、扩大生产规模，可从以下几个方面寻求解决策略：简化提取物制备程序、开发蛋白质合成的新能源再生系统、稳定底物供应和制备高效的正交翻译系统。

在未来的发展中，无细胞体系需要进一步优化以提高效率、降低成本，同时提高生物大分子（RNA和蛋白质）合成的个性化、多样化、普适性和稳定性；无细胞系统的使用寿命需进一步延长，需要朝着能够实现自我复制的无细胞合成系统迈进；需要进一步融合先进材料学、人工智能和生物医学等多学科领域，展现出无细胞合成系统更广泛的应用潜力。

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